エジプトの乳製品から分離した有望なラクトバチルス・デルブルッキ亜種ブルガリクス株の全ゲノム配列解析によるプロバイオティクス特性の解析 | Scientific Reports

Scientific Reports 第15巻、論文番号：6901（2025） この記事を引用

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プロバイオティクスは、適切な量を摂取することで人間の健康に良い影響を与える生きた微生物です。セルフケアへの世界的な関心が高まる中、特にプロバイオティクスを含む栄養補助食品は、その健康効果の裏付けから急速に普及しています。本研究では、エジプトの市場で販売されている乳製品から計22のサンプルを採取し、まず分離、同定を行い、塩化ナトリウム、酸性、胆汁酸塩などのストレス条件下でのプロバイオティクス特性をスクリーニングしました。広く蔓延しているグラム陰性菌およびグラム陽性菌によるヒト感染細菌に対する抗菌効果を評価した後、世界を不安にさせているSARS-CoV-2ウイルスに対する抗ウイルス効果を評価し、抗生物質感受性試験を実施しました。有望な分離株3株のみを次世代高出力技術を用いて全ゲノム配列解析し、得られたデータを完全なバイオインフォマティクス解析にかけました。得られた結果は、本分離株がヒトの腸内で起こりうるストレス要因への耐性と抗菌効果において優れていることを示しています。これらの優れた特性はすべて、信頼性の高い様々なゲノム解析ツールによって確認され、詳細に説明されています。当社の分離株は、ファージやCRISPRクラスターといった可動性遺伝子要素を含むことで安定したゲノム構造を有しており、人体への安全性と品質が保証されています。

プロバイオティクスとは、適切な量を摂取することで人間の健康に有益な影響を与える生きた細菌です1。細菌株が安全性、有用性、そして技術基準を満たしている場合、プロバイオティクスと呼ばれることがあります。安全性要件は、動物またはヒト由来であること、健康な人の腸から抽出されていること、安全な使用実績があること、そして菌株と感染症との関連を示唆するデータがないことです2。菌株は、腸内細菌叢が放出する酸耐性、菌体、胆汁酸塩などの機能パラメータを満たす必要があります。さらに、腸内で生存し、代謝と増殖を行い、病原体への抵抗力を持ち、腸内で定着する能力も備えています。ゲノムの安定性、バクテリオファージへの耐性、加工・保管中の最終製品の生存率と耐久性はすべて、プロバイオティクスの技術的有用性に寄与する要因です2。プロバイオティクスは健康に良い影響を与えることから、抗菌療法の前後に摂取することが推奨されています。体内の常在微生物叢の回復を促し、消化器系を助け、栄養素やビタミンの吸収を高め、足のアレルギーを緩和する効果があります3,4。さらに、プロバイオティクスは体脂肪の抑制、脂質成分の改善、炭水化物の分解を促進し、さらには宿主の免疫力を高めるためにも用いられています5。調査対象となっているプロバイオティクス微生物叢の中で、乳酸菌（LAB）は特に優勢で、広く分布し、ヒトの腸管粘膜上皮に広く生息しています。多くのLAB属は、伝統的および産業的に重要な発酵乳製品に広く利用されており、特にラクトバチルス・デルブルッキ亜種ブルガリクスが有名です6。グラム陽性、非胞子形成性、桿菌性、または球菌性のL. delbrueckii細菌は、通常、GCゲノム比が50%未満です7。L. delbrueckiiは、ヨーグルトやチーズなどの様々な発酵乳食品の製造における原料菌として利用されており8、米国食品医薬品局（FDA）によって安全性（GRAS）が認められています9。さらに、乳製品由来であるため、その栄養補助食品の配合は容易です。

本研究は、地元の乳製品由来のL. delbrueckii株のプロバイオティクスとしての性質を、生化学および分子生物学的分析、そして全ゲノム配列解析によって検証することを目的としています。この株のWGSは、in vitro安全性評価の基礎として用いられ、ヒトへの医薬品としてのin vivo試験によって検証されます。ゲノム配列解析は、種の生物学的特性に関する知見を提供し、特定の株に特異的な遺伝子、その転写産物、抗菌作用、およびプロバイオティクス特性の検出に役立ちます。

エジプトの散発的な市場で、地元の天然乳製品および市販の乳製品（カッテージチーズ、ヨーグルト、サワーミルク）から22個のサンプルを採取しました。採取した検体は包装・マーキングされ、ポリエチレン製の保冷容器に直ちに入れられ、エジプト・カイロのアルマザ近郊にある感染症・新興疾患バイオディフェンスセンター10に移送されました。de Man-Rogosa-Sharpe MRSブロス（Merck社、ドイツ）に緩衝ペプトン混合物1mLを添加し、37℃で24時間培養した後、カードサンプルをペプトン水緩衝液10mL中でストマッカーブレンダーを用いて混合し、37℃で18時間培養しました。増殖中の標本 0.1 ml を MRS 寒天培地 (Merck、ドイツ) プレートに加え、嫌気容器とガスバッグを使用して 37 °C で 48 時間嫌気培養し、乳酸菌 11 を分離しました。

MRS寒天培地上で、透明な単一陽性コロニーを3回継代培養し、精製しました。分離培養物ごとに、コロニーの形状、色、境界、不透明度などの表現型検査と、グラム染色後の顕微鏡検査を行いました12。製造元の指示に従い、VITEK® 2Cシステム（bioMérieux、フランス）と推奨のANCカードを用いて、正確な同定と生化学的確認を行いました13。

グラム陽性桿菌として認識されているラクトバチルス分離株は、塩化ナトリウム、胆汁酸塩、酸、抗生物質に対する耐性、および特定の病原微生物を阻害する能力について評価されました。

各分離株について、化学実験標準協会14の推奨手順M7-A7-CLSIに従い、5mlのブイヨン培地を加えた試験管で接種液を調製し、37℃で24時間培養した。接種液の濁度は107～108 CFU/mlで、マクファーランド基準値0.5を維持した。

Uymaz Tezelら15が示したように、若干の改変を加えてNaCl耐性を測定した。MRSブロス（Merck社、ドイツ）を様々なNaCl濃度（0、3、4、5、6、7）（w/v）に改変した。改変MRSで調製した新鮮な一晩培養物に、ラクトバチルス分離株の1%（v/v）を接種し、37℃で2～5時間、嫌気培養した。試験は3回法で実施し、純粋なMRSブロスを対照サンプルとして使用した。2時間後および5時間後に、600 nmの吸光度を測定した。

Shaikh & Shah16 が示したように、分離株の酸性培地での生存率を調べた。MRSブロスで一晩培養した培養物（1.3 × 109 CFU/ml）を5000 rpmで10分間遠心分離した。ペレットをpH（3、4、5、6）およびpH 7（対照）に調整したPBS緩衝液に再懸濁し、37℃で2時間および5時間培養した後、各実験株の1%を新鮮なMRSブロス（pH 7）に添加し、3回に分けて37℃で24時間培養した。増殖はOD600で測定した。耐酸性分離株は、pH 4で50%以上の生存率を示したものと定義した。

各分離株の胆汁酸塩耐性を、Vinderola および Reinheimer17 の方法論に従って評価しました。各分離接種懸濁液 (107-108 CFU/ml) から 200 µL を、胆汁酸塩濃度の異なる (0.1、0.2、0.3、0.4、0.5% w/v) MRS ブロス 1000 µl に接種し、胆汁酸塩を含まないコントロール MRS ブロスと共に、37℃ で 2 時間および 5 時間インキュベートしました。インキュベーション後、コントロールと比較するために 600 nm で光学密度 (OD) を評価しました。0.3% 胆汁酸塩投与量で 50% を超える耐性を示した分離株は、胆汁酸塩耐性株に分類されました。耐性率は、両方のシナリオ (酸性 pH / 胆汁レベル) で次のように評価しました。

各分離株の抗生物質感受性は、ミューラーヒントン寒天培地（MHA）18を用いたディスク拡散法を用いて評価した。夜間試験接種菌液（107～108 CFU/ml）の濁度は、マクファーランド比0.5に調整した。各分離株は、メチレンブルー（0.5 g/ml）と5%脱線維素馬血を混合したMHAに接種した。BD BBL™ Sensi-Disc™抗生物質感受性ディスクを滅菌ピンセットで画線培養物上に配置した。試験用プレートは2時間冷蔵した後、35℃で20時間培養した。抑制リング径は、英国臨床標準研究所（LCIS）19のガイドラインに従って評価した。

グラム陰性およびグラム陽性病原菌（S. aureus、S. typhimurium、K. pneumenia、E. coli、E. fecalis、L. monocytogensを含む）に対する全ての分離株の抗菌効力を、MHAプレート上で従来のウェル拡散法20により評価した。各MHAプレートに細菌懸濁液（107～108 CFU/ml）100µlを接種した。感染させたプレートの各ウェルに、MRS培地で24時間培養した接種菌を4000rpmで10分間遠心分離して得たラクトバチルス無細胞上清液30µlを注入した。陰性対照としてMRS培地を用い、陽性対照としてシプロフロキサシン（30µg/ml）を用いた。試験対象株の乳酸による抑制ではないことを確認するため、上清培地のpHを6.5に調整しました。全ての培養皿を37℃で24時間培養し、自動コロニーカウンターSphere Flash（IUL、バルセロナ）を用いて阻止円を評価しました。抑制円の直径が10mm以上の分離株で抗菌効果が認められました。

SARS-CoV-2ウイルス（COVID-19）に対する有望な分離株の抗ウイルス効果を評価するため、細胞毒性およびプラーク減少試験を実施した。検査した分離株のVero E6細胞の生存率および増殖に対する細胞毒性効果は、Mosmannのガイドライン21に従って若干の修正を加えた3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物（MTT）法を用いて評価した。10% DMSOで分離株のストック濃度を調製した後、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で段階希釈を実施した。要約すると、濃度（3×105細胞/ml）の細菌懸濁液100µlを接種し、5% CO2で37°Cで24時間インキュベートした。 24時間後、培地を除去し、細胞株をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で3回よくすすいだ後、MTT（5 mg/ml）20 µlを接種した。細胞を37 °Cで4時間インキュベートし、培地を吸引した。結晶化したホルマザンは、酸性イソプロパノール（純イソプロパノール中の0.04 M HCl）200 µlを用いて溶解した。ホルマザン混合物の吸光度は、適切なスキャナーを用いて波長540 nmで測定した。標準波長は620 nmとした。未処理細胞に対する細胞毒性比を求める式は以下のとおりである。

サンプル濃度と細胞毒性率をグラフ化して決定し、細胞生存率を 50% 低下させるサンプル濃度を (CC50)22 と呼びます。

プラーク減少実験は、6ウェルプレートにVero E6細胞（1×106細胞/ml）を接種し、5％CO2で37℃で24時間培養することで実施した。分離株の安全希釈液（10−4、10−5、10−6、10−7）100µlを希釈したCOVID-19（8×104 PFU/ウェル）と混合し、播種培地を取り除いた後、細胞に接種する前に37℃で1時間インキュベートした。ウイルス吸着のために1時間インキュベーションした後、2％アガロースを含む強化DMEM 3mlを添加した。固化したプレートは、ウイルスプラークが発生するまで37℃で3日間保持した。10％ホルマリンを2時間添加した後、洗浄前に0.1％クリスタルバイオレットを添加した。未処理ウイルスに感染したウェルを陽性対照とした。最後に、プラーク数を数えた後、以下の式を用いて対照群に対するプラークの減少率を算出した。

GraphPad Prism®（GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州サンディエゴ）バージョン8を用いて、データの減少率と対応する濃度値について非線形回帰分析を実施し、シグモイド型の用量反応曲線を作成しました。この曲線から、ウイルス数を50%減少させるために必要な推定濃度（IC50）を決定しました22。調査対象株の細胞毒性と抗ウイルス活性の差を評価する選択性指標23は、以下の式を用いて決定されました。

PureLink™ゲノムDNA精製キット（Thermo Fisher Scientific Inc、米国）を用いて、分離株の培養液からゲノムDNAを抽出した。メーカーの指示に従い、遠心分離後、最大（2 × 109）個のコロニーを採取し、酵素ゲノム消化バッファーを用いて可溶化した。プロテイナーゼKを添加し、細胞が溶解するまで55℃で30分および4時間インキュベーションした。続いてRNase Aを添加し、ゲノム溶解/結合バッファーを用いて室温で2分間インキュベーションした後、十分に混合した。内容物全体を100%エタノールでよく混合し、AW1およびAW2バッファーでそれぞれ2回洗浄した。溶出した DNA は、メーカーの指示に従って、校正済みの Qubit™ 2.0 蛍光計 (Invitrogen、米国)、DNA HS アッセイ キット、Nanodrop 8000 (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を使用して濃度と純度を定量し、使用するまで -20 °C で保管しました。

メーカーのガイドラインに従い、Nextera-XT DNA Library Prepキット（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、初期DNA濃度1 ng/µlでDNAライブラリを調製しました。検査対象のゲノムDNA（gDNA）の断片化とタグメンテーションには、（i7）および（i5）インデックスアダプターを組み込むことで、Nexteraトランスポソームを使用しました。増幅されたライブラリは、片面Agencourt AMPure XPビーズで精製し、その後、標準化と希釈を行いました。サンプルの複雑さに応じて、1回のランで3つ以上のサンプルをプールすることが可能です。その後、エジプト国防省、感染症および新興疾患のためのバイオ防衛センター、ゲノム研究ユニットにあるMiseqプラットフォーム（Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）で、クラスター生成用のIllumina MiSeq 300サイクルカートリッジキットを使用してシーケンスできます。

シーケンスランパラメータの一次解析は、ラン終了後に機内で実施しました。生のリードにはFastQC（バージョン0.12.1）を使用しました24。アセンブリ品質評価は、PATRIC（PathoSystems Resource Integration Center）ソフトウェア25で利用可能な完全ゲノム解析アプリケーションを使用して実施しました25。FastQCとQUASTを用いた事前解析で良好な品質が得られたデータは、RASTtk（Rapid Annotation using Subsystem Technology tool kit）26を用いてアノテーションされました。

代表ゲノムと最も近い参照ゲノムを特定するために、Mash/MinHash法が用いられました27。これらのゲノムから系統分類を決定するために、PGFams（PATRIC global protein families）が選択されました28。これらのファミリーのタンパク質配列は、MUSCLE（Multiple Sequence Alignment）29を用いてアラインメントされ、各配列のヌクレオチドがタンパク質アラインメントに割り当てられました。統合されたヌクレオチドとアミノ酸のアラインメントをデータマトリックスに連結した後、RaxML（Randomized Axelerated Maximum Likelihood）30を用いて、このマトリックスを効率的にブートストラップし、解析を行いました31。

プロバイオティクス特性に関連する遺伝子群は、antiSMASH 7.032を用いて同定されました。抗生物質耐性遺伝子は、ARTS 2.0（Antibiotic Resistant Target Seeker）33、PATRICのk-mer解析に基づくAMR遺伝子同定ツール、およびResFinderソフトウェア（バージョン4.5.0）34を用いて同定されました。推定されるモビロームとファージはPhaBOX35を用いて解析されました。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）およびCRISPR/Cas（CRISPR関連遺伝子）は、CRISPRCasFinder36を用いて同定されました。

各特性試験は3回実施され、標準偏差が算出されました。統計解析はGraphPad Prism 6.0を用いて実施しました。p値が0.05未満の場合、統計的に有意と判断されました。

分離検体22個のうち14個がMRS選択培地でラクトバチルス属菌と同定されました。白色で滑らかな粘液性のコロニーを顕微鏡で観察したところ、グラム陽性桿菌であることが確認されました。VITEK® 2C自動プラットフォームにより、5つの分離株がラクトバチルス属菌と同定され、生化学的に確認されました。これらの分離株は、プロバイオティクスの特定の特性に基づいてさらに評価されました。

5種類の乳酸菌分離株を異なる塩化ナトリウム濃度で評価したところ、耐性株は3%、4%、5%の濃度でのみ良好な生育を示しましたが、6%および7%の塩化ナトリウム濃度では生育が鈍化しました。7%の塩化ナトリウム濃度では、2時間後および5時間後のいずれにおいても生育が著しく減少しました（表1）。

5%濃度のNaClで良好に生育した3株は、低pHでも生存を示し、酸ストレスに対する耐性を示した。耐性株はpH 4でも生存した（耐性率 > 50%）。pH 4では、5時間後、G1株（83.19%）が最も耐性が高く、B1株（71.55%）が最も耐性が低かった（表2）。pH 3では、耐性株は確認されなかった（耐性率 < 50%）。

胆汁酸塩濃度の上昇に伴い、阻害効果が観察されましたが、試験した3つの分離株は培養期間の延長に伴い生育を維持しました（耐性率50%以上）。しかし、胆汁酸塩濃度0.5%では耐性がありませんでした。最も高い耐性はB2（58.04%）で、最も低い耐性はG1（50.15%）で、5時間後には0.4%でした（表3）。しかし、0.5%濃度で耐性を示す分離株は見つかりませんでした（耐性率50%未満）。優れた分離株であっても、胃やヒトの腸管に類似したストレス条件に耐えるには、どのような課題が伴うのかは、図1に示されています。

MRS ブロス中で 37 °C で 2 時間および 5 時間培養した後、さまざまな濃度 (pH - NaCl - 胆汁酸塩) に耐えるラクトバチルス分離株 (B1 - B2 - G1 - S5 - S8) の能力。

本試験における抗生物質耐性は、MHAプレートを用いてディスク拡散法で調査され、その結果は（表4）に示されている。3つの分離株は厳しい因子に対して耐性を示し、シプロフロキサシン、クロラムフェニコール、アジスロマイシン、ネオマイシン、ナリジクス酸、クラリスロマイシンにはそれぞれ高い感受性を示したが、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アンピシリンには感受性を示した。特に、これらの分離株はセフトリアキソン、ペニシリン、トリメトプリムに対して共通して低い感受性を示した。プロバイオティクス微生物が抗生物質耐性特性を示すことは、消化器系における抗生物質療法に耐えるために有利である。

6種類の病原菌を用いて、評価対象分離株の抗菌効果を調べた（図2）。試験した細菌無細胞液は、調査対象とした病原菌に対して阻害作用を示した。S. aureusは、調査対象とした全ての分離株に対して極めて感受性の高い病原菌であった。分離株B1は最も高い抗菌力を示した。

L. delbrueckii 分離株の病原細菌に対する抗菌活性。

試験した分離株（B1-B2-G1）の連続濃度がVero E6細胞株の生存率に及ぼす24時間細胞毒性効果は、（10-4、10-5、10-6、および10-7）の濃度で安全であることが示され、これらの濃度におけるCOVID-19に対する抗ウイルス効果について調査しました。結果は（表5）に示す通り、阻害率を示しました。分離株B1が活性阻害剤として同定されました。

ラクトバチルス（Lactobacillus）株の包括的なゲノムシーケンシングを実施しました。シーケンシングは、Nextera XTライブラリ調製キットを用いた調査中に発見された3つの潜在的サンプルについて、Miseqマシンを用いて実施しました。解析データからは合計1350 k/mm²のクラスターが得られ、そのうち90.8%がクラスターPF、リード1で96.5%のQ30、リード2で97.5%のQ30に分類されました。

生のシーケンスデータのFastQC品質管理評価において、生のリードは良好な品質スコアを示しました。結果は、サンプル番号1（B1）が639個のコンティグ、ゲノムサイズ3,954,441 bp、G+C組成44.20%を生成したことを示しています。ゲノムの50%を占める最短のシーケンス断片を表すN50長は28,871 bpです。L50カウントを決定するN50を達成するために必要な最小コンティグ数は32です。サンプル（B1）はRASTtk（RASTツールキット）を使用してアノテーションされ、以下の特定の分類カテゴリが割り当てられました：細胞生物 > 細菌 > テラバクテリア > フィルミクテス門 > バチルス > 乳酸菌目 > 乳酸菌科。このゲノムには、4,691個のタンパク質コード配列（CDS）、100個の転移RNA（tRNA）遺伝子、および7個のリボソームRNA（rRNA）遺伝子が含まれています。アノテーションには、1,339個の仮説タンパク質と、機能割り当て済みの3,352個のタンパク質が含まれており、これには1,156個のEC番号（酵素委員会による指定を受けたタンパク質）、981個のGO割り当て（遺伝子オントロジー分類を受けたタンパク質）、KEGGパスウェイ37,38にマッピングされた820個のタンパク質、およびPGFams（属間タンパク質ファミリー）に分類された4,420個のタンパク質が含まれます。

配列解析されたサンプル（B1、B2、G1）のゲノム特性は表6に詳述されている。B2およびG1とラベル付けされたサンプルからは、それぞれ1022および929のコンティグが得られ、ゲノム長はそれぞれ2,136,850および5,499,788 bpで、非典型GC含量はそれぞれ49.14%および46.29%であった。N50長はそれぞれ5,801および18,019 bp、L50数はそれぞれ91および69であった。アノテーションは、両ゲノムがLactobacillaceae科に属することを示している。ゲノムには、それぞれ2,896および6,422のコード配列（CDS）、4および15のrRNA遺伝子、および62および139のtRNA遺伝子が含まれている。注釈には、906 個と 1,867 個の仮想タンパク質、および機能割り当て済みの 1,990 個と 4,555 個のタンパク質が含まれており、651 個と 1,660 個の EC タンパク質、543 個と 1,355 個の GO 割り当て、および KEGG パスウェイ 37,38 にマッピングされた 446 個と 1,134 個のタンパク質、および 2,691 個と 6,051 個の PGFams タンパク質として分類されています。

ゲノムアノテーションの割り当ては、図3の円グラフで示されています。外側から内側のリングに向かって、コンティグ、順方向鎖のCDS、逆方向鎖のCDS、RNA遺伝子、既知の抗菌薬耐性遺伝子と相同なCDS、既知の毒性因子と相同なCDS、GC含量、およびGCスキューが含まれています。これらの遺伝子に関連するサブシステムは、順方向鎖と逆方向鎖の両方のCDSの色で示されています（図4）。

ゲノムにマッピングされた注釈全体にわたるコンティグの分布を示す円形グラフ。

サブシステムとは、特定の生物学的タスクまたは構造複合体を協調的に実行するタンパク質の集合体です。PATRICアノテーション手順には、各ゲノムに固有のサブシステムの解析が含まれます。(図4)は、これらのゲノムのサブシステムの内容をまとめたものです。サブシステムの主な特徴には、代謝プロセス、タンパク質処理、防御、ストレス反応、エネルギー、毒性、細胞活動、DNA処理、RNA産生、細胞外膜、膜輸送、その他の操作、調節、細胞シグナル伝達などがあります。

サブシステム (サブシステム、遺伝子) の円形ダイアグラム表現。

これら3株は、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricusと最も高い配列一致を示しました。ヌクレオチドとアミノ酸のアライメントを連結してデータマトリックスを作成し、全ゲノム配列から系統樹を構築しました。その後、RaxMLを用いて解析を行い、Lactobacillus株間の系統関係を解明しました（図5）。

系統樹は、隣接する分類法において当社の分離株が分類される優勢な株を示しています。

多数のアノテーション付き遺伝子は、既存の薬剤標的遺伝子、トランスポーター遺伝子、および抗生物質耐性遺伝子と相同性を示しています。ゲノム中にAMR関連遺伝子が存在することは、必ずしも抗生物質耐性表現型を示すものではありません。これは、ResFinderソフトウェア（バージョン4.5.0）によって実証されており、サンプルには耐性表現型が見られなかったことが示されています。耐性を示すSNP変異の有無を含め、特定のAMRパスウェイを調査することが不可欠です。表7は、このゲノムで見つかったAMR遺伝子と、対応するAMRパスウェイの概要を示しています。

AntiSMASHは、細菌ゲノム全体にわたって二次代謝産物の合成に関連する遺伝子クラスターの迅速な同定、アノテーション、および解析を容易にします。その結果、二次代謝産物、特に生合成遺伝子に関与する領域が、（表8）に示すように、解析対象とした分離株のゲノム内の様々なコンティグ上に存在することが明らかになりました。B2分離株における二次代謝産物のゲノム分布は（図6）に示されています。

B2 分離株のゲノム全体にわたる二次代謝産物の豊富さをグラフで表したもの。

ARTS ソフトウェアは、(B1) 分離株の contig_66 および contig_269 のバクテリオシン責任遺伝子に加えて、コア/必須遺伝子に関する AntiSMASH から得られたすべての結果分析を検証し、(B2) にはヒットがなく、(G1) 分離株の contig_5、contig_124、および contig_425 のバクテリオシンの局所ヒットがありました。

サンプル全体にわたるさまざまなファージの出現率を示す棒グラフ (B1、B2、G1)。

適切な宿主を識別するために（B1）分離株のいくつかのファージセグメントを並べた図。

プロファージやその他の挿入配列などの可動性遺伝要素は、研究対象の分離株で PhaBOX オンライン ソフトウェアによって検出された。すべての分離株は、毒性または温和性のファージ配列を持つと判定された。検査したサンプル (B1、B2、G1) 内のさまざまなファージの相対的な豊富さを (図 7) に示します。分離株 (B1) には 10 個のファージ配列があり、そのうち 3 個のファージは (ペデュオウイルス科、ヘレレウイルス科、アッカーマンウイルス科) の科に属し、(図 8) で明らかにされているように、L. delbrueckii などのいくつかの適切な宿主と相関していました。分離株 (B2) には 8 個のファージが示され、そのうち 3 個は (ペデュオウイルス科、ジエルトウイルス科、ヘレレウイルス科) に属していました。分離株 (G1) には最も多くのファージ (24) があり、残りの同定されたファージは未知のファミリーに属していますが、（表9、10、および11）に示すように適切な宿主に対応しています。

各分離株について、予想されるCRISPR-Casコード配列を調べた。3つの分離株全てにおいて、1つ以上の関連Cas遺伝子またはコンセンサスリピートを含む反復配列と、後続の表に示すスペーサー遺伝子が認められた。これらの分離株はそれぞれ（12、4、23）個のCRISPR配列を有し、同じ配列内の（9、4、10）個のCasと相関し、（表12、13、14）に示すように、配列（B1、B2、G1）において（28、12、31）個のクラスターと区別された。

世界保健機関（WHO）は、プロバイオティクスを「適量を投与することで宿主に健康上の利点をもたらす生きた微生物」と定義しています。現在、市場に出回っている多くの食品には、一般的な健康上の利点を約束する生きた微生物が意図的に添加されています。プロバイオティクスは、世界中で幅広い製品に利用されています。プロバイオティクスは、医薬品、動物飼料、食品に利用されてきました。エジプトの医薬品市場で入手可能な栄養補助食品に使用されているプロバイオティクスはすべて海外からの輸入品であるため、食品や医薬品に処方されるプロバイオティクスとして有望なエジプト産菌株を発見し、その特性を明らかにする必要性が生じました。in vitroにおけるプロバイオティクスの選択に用いられるパラメータには、酸耐性と胆汁耐性があり、これらによりプロバイオティクスはGIT（消化管）内で生存し、繁殖することができます39。

私たちの研究では、エジプトのさまざまな市場で地元の天然乳製品と市販乳製品から22のサンプルを採取し、MRS寒天培地で培養しました。その結果、B1、B2、G1、S5、S8の5つの分離株のみがラクトバチルス属菌であることが確認されました。99%の優れた確認率で、プロバイオティクス特性を解析しました。この5つの分離株のうち、B1、B2、G1の3つの分離株は、5時間後に5% NaClに高い耐性を示し、pH 4でも良好に生存しました(耐性＞50%)。5時間後、pH 4では、G1(83.19%)で最も高い耐性が見られ、B1(71.55%)では最も低い耐性が見られました(表2)。しかし、pH 3では耐性を示す分離株(耐性率＜50%)はありませんでした。菌株が胃(pH 2～3)での初期ストレスに耐えるためには、酸性pHでの持続性が重要です11,40。

Idoui41は、L. plantarum BJ0021がpH3.0で生存することを実証し、ヒト消化管から分離されたラクトバチルスと比較して、L. fermentum、L. delbrueckii subsp. bulgaricus、およびL. gasseri株はより高い耐酸性を有することを明らかにした。さらに、耐酸性分離株は0.4%の胆汁濃度下でも5時間生存した。耐酸性分離株はB2（58.04%）が最も高く、最も耐性が低かったのは5時間後に0.4%に達したG1（50.15%）であった（表3）。一方、0.5%では耐性を示す分離株はなかった（耐性率50%未満）。これは、プロバイオティクス分離株がpH3および0.3%胆汁に対して耐性を示すというエビデンス16と整合している。 Gillilandら42によると、動物の腸管から分離された乳酸菌は、乳製品から分離された乳酸菌と比較して、胆汁酸塩に対する高い耐性を示した。Patelら43も同様の結果を得た。Gillilandら44は、牛の腸管から分離されたL.アシドフィルス菌株は、in vitroにおける胆汁酸塩環境下での生存能力に大きなばらつきがあることを発見した。Garrigaら45は、選択されたLAB株が4%の胆汁酸塩に対して耐性を示すことを実証した。乳酸菌の耐性が変動するのは、胆汁を抱合して毒性効果を軽減する加水分解酵素（胆汁酸塩酵素）の存在によるものである46。

抗生物質感受性は、プロバイオティクス培養物の選択における適切なパラメータとなり得る47。検査した全ての分離株の各種抗生物質に対する感受性は、寒天ディスク拡散法を用いて測定した。選択された分離株は、L. casei が多数の市販抗生物質によって抑制されることを発見した Botes ら48 の結果と一致して、いくつかの抗生物質に対する耐性を示した。乳酸菌は、細胞壁を標的とするペニシリンおよびβ-ラクタマーゼには感受性であるが、セファロスポリンには耐性である49。核酸合成に対するほとんどの阻害剤は、乳酸菌株の大部分に対して阻害効果が小さいようである。しかし、乳酸菌は、その耐性遺伝子の存在のため、テトラサイクリンやクロラムフェニコールなどの各種タンパク質合成阻害剤の低濃度に対して感受性を示すことが多かった。これらの遺伝子は、他の阻害剤と組み合わせて同定されることもあった50。 LABにおける抗生物質耐性は、抗生物質治療中の消化管での生存を促進する一方で、ストレス因子に対する耐性株は、ネオマイシン、クラリスロマイシン、シプロフロキサシン、クロラムフェニコール、ナリジクス酸、アジスロマイシンに対しては高い感受性を示し、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、エリスロマイシン、アンピシリンに対しては感受性を示しました。特に、これらの株はセフトリアキソン、トリメトプリム、ペニシリンに対する感受性が低下しています。

プロバイオティクス菌は、消化管内の病原菌種を抑制し、免疫力を強化することで人々の健康に重要な役割を果たすため51,52、抗菌作用はプロバイオティクスの主要な特性の一つです。そのため、選択された分離株は、（図2）に示すように6つの病原菌に対して評価されました。すべての細菌上清液は、試験対象の病原菌に対する阻害効果を示しました。試験したすべての上清液に対して、S. aureusが最も感受性の高い病原菌でした。分離株B1は最も強力な分離株でした。Tulumogluらは、S. aureus、P. aeruginosa、およびE. coliに対するプロバイオティクスの抗菌効果を調べました47。プロバイオティクス株の抗菌活性は、pH値、資源の競合、またはバクテリオシンやバクテリオシン様物質などの細菌静止または殺菌特性を示す化学物質の生成に関連している可能性があります53,54。酢酸、乳酸、二酸化炭素、ジアセチル、アルデヒド、過酸化水素などの抗菌代謝物や、病原微生物を阻害するその他の化合物55。

予想通り、抗菌分離株はVero E6細胞株を用いた24時間の安全生存試験後、SARS-CoV-2に対する抗ウイルス活性を示しました。表5の結果は、活性阻害株であるB1分離株の阻害率を示しています。

酸性pH、胆汁酸塩、および一部の抗生物質に対する耐性を示す有望な分離株B1、B2、G1は、抗菌作用および抗ウイルス作用も示したことから、さらなる研究のために選定されました。乳由来のすべての分離株とその様々なプロバイオティクス特性について、ヒトへの使用における有効性と安全性について調査しました。すべての分離株について、ハイスループット全ゲノム次世代シークエンシングを実施し、機能特性を評価しました。この技術は依然として高価ですが、WGS技術に関連する費用は過去10年間で劇的に低下しており、次世代システムの登場とともにさらに低下し続けています56。

DNAの次世代シーケンシングは、物質の識別と分析のための包括的なアプローチとして急速に普及しています。WGSによって得られた生データは、方法論で述べた様々なパイプラインを通して分析されました。この技術は、株スケールでの微生物の同定など、必要とされる分類学的精度に合わせて調整可能です57。一般的に、ハイスループットシーケンシングは、検査された株の価値を要約した優れたデータを提供しました。WGSは、オンボード一次解析から得られた優れたパラメータを用いて、B1、B2、G1分離株の解析に成功し、総クラスター数1350 k/mm2、クラスターPF90.8%、総Q3097%という結果を得ました。その後、生データに対して追加評価が行われ、FastQCツールで高い品質スコアが得られました。

すべてのリードをアセンブルし、アノテーションを付与した結果、B1分離株では（ゲノム長3.9 Mbpのコンティグ639個、GC含量44.20%）、B2分離株では（ゲノム長2.1 Mbpのコンティグ1022個、GC含量49.14%）、G1分離株では（ゲノム長5.5 Mbpのコンティグ929個、GC含量46.29%）という結果が明らかになりました。オミクスベースの技術と遺伝子配列解析は、代謝、ゲノム適応性および安定性、抗菌薬耐性表現型の発見、毒性指標および安全性に関連する、プロバイオティクスに関連する可能性のある責任遺伝子を特定するための効果的なアプローチです。さらに、in vivo、in vitro、およびオーミクス研究は、酸性環境、胆汁酸、抗菌物質、免疫調節、接着機構への耐性など、適切な細菌とその関連するプロバイオティクス能力を検出するために利用されてきました58。プロバイオティクスは、腸内細菌叢を変化させることで、病原体の定着を抑制し、宿主の免疫反応を調節し、血清コレステロールを低下させ、抗糖尿病作用、抗高血圧作用、抗酸化作用を発揮し、バクテリオシンを生成することで、摂取者に健康上の利点をもたらします59。これら3つの分離株はすべて、Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricusと密接な関係があります。系統樹は、ヌクレオチドとタンパク質のアラインメントを連結マトリックスに統合した後に構築され、広範なゲノム研究の一部としてPATRICおよびRaxMLを用いてデータが分析されました。これらのデータはすべてNCBIデータベースに送信されました。

これらのゲノムサブシステムの値は（図4）に示されており、代謝プロセス、タンパク質処理、防御、ストレスへの反応、エネルギー、毒性、細胞活動、DNA処理、RNA生成、細胞外膜、膜輸送、その他の操作、制御、および細胞シグナル伝達によって最もよく表されています。 私たちの研究では、抗菌薬耐性、プロファージなどの可動性遺伝要素、およびCRISPR / Casシステムスクリーニングのためにゲノムが研究されました。 微生物叢が病原性微生物に抗生物質耐性遺伝子を伝達する可能性があるため、抗生物質耐性は懸念されます60。 ウェブベースのバイオインフォマティクスアプリケーションResFinderとARTSを使用して、ゲノム研究では、抗生物質耐性に関連する表現型または遺伝子型は見つからないことが明らかになりました。 乳酸菌は、in vitro研究61に基づいて抗生物質感受性で知られています。 この発見は、細菌がさらされた環境またはストレスによって影響を受けた可能性が最も高いです。コア/必須遺伝子に関連する ARTS ソフトウェアの結果分析により、すべてが AntiSMASH からの結果であることが確認されました。

本研究では、PhaBOXオンラインツールを用いて、毒性または非毒性のプロファージ配列を発見しました。同定されたファージのほとんどは、L. delbrueckiiなどの特定の宿主と相関する（ペデュオウイルス科、ヘレレウイルス科、アッカーマンウイルス科、ジエルトウイルス科、およびカシェンスウイルス科）科に属していました。

一方、プロファージは、個体の消化管での発育と生存を調節することによって宿主のゲノム弾力性に関与し、同時に侵入する病原性バクテリオファージや抗菌剤から宿主細胞を保護します62。

表11、12、13に示すように、分離株はゲノム内にCas遺伝子およびスペーサーとともにCRISPRクラスターを有しています。ゲノム内のCRISPRクラスターは、水平遺伝子伝播の複数のプロセスを阻害することで、抗菌薬耐性遺伝子の拡散を阻害します63。有効なCRISPRセグメントの存在は、菌株にファージ、プラスミド、挿入配列に対する配列特異的な防御機構を提供します。CRISPR遺伝子座は、関連するCas遺伝子とともに、宿主菌株に侵入する染色体外遺伝子実体に対する防御能力を提供します64。これは、解析したゲノムの安定性を示しており、耐性遺伝子は多くの場合、可動性遺伝子成分によって拡散するため、菌株が抗菌薬耐性遺伝子を獲得する可能性は低いことを示しています。

CRISPR-Casシステムは、可動性遺伝因子（MGE）に対する強力な適応免疫防御を提供する一方で、その防御効果を損なう可能性のあるいくつかの制約も抱えています。これらの制約には、MGEのプロトスペーサー領域におけるエスケープ変異の出現が含まれます。ファージやプラスミドなどのMGEは、高い変異率を有するため、Casタンパク質による標的の認識と切断が阻害されます65,66。さらに、MGEは抗CRISPR（Acr）タンパク質を獲得し、CRISPR-Cas経路の様々な段階を直接阻害することで、宿主の防御を効果的に無効化します67,68。CRISPRアレイ内のスペーサーの多様性が限られていることも脆弱性をもたらします。宿主のアレイに存在しない標的配列を持つMGEは認識を逃れることができるからです69。最後に、Casタンパク質の活性には特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）が必要であるという制約も、適切なPAMを持たないMGEは標的化を逃れることができるという制約をもたらします70。これらの制限は、細菌とその可動性遺伝要素の間で進行中の進化的軍備拡張競争を浮き彫りにし、CRISPR-Cas システムが MGE 侵入に対する大きな障壁を提供する一方で、完全な保護を提供しないことを示しています。

結論として、5つのラクトバチルス分離株のうち3つの潜在的なプロバイオティクス分離株のプロバイオティクス特性をスクリーニングしました。有望なサンプルはエジプトの地元の乳製品（ヨーグルトと酸乳）から分離され、L. delbrueckii subsp. bulgaricusとして同定および確認されました。これは、NaCl、酸、胆汁酸塩などのストレスの多い状況に耐える能力と抗菌活性に関連しています。抗生物質耐性を持つプロバイオティクス株を抗生物質コースと併用すると有利になる可能性があります。in-silico法を使用して、ゲノムを特徴付け、これらの分離株のプロバイオティクス特性に関する生理学、安全性、および有効性に関する知識を得るための研究が行われました。この研究で毒性因子と病原性が存在しないことは、その有利な性質を強調しており、プロバイオティクスサプリメントとして使用するための実行可能な選択肢となっています。ゲノムの柔軟性は、抗生物質耐性遺伝子の欠如ではなく、可動性遺伝子成分とプロファージの存在によって影響を受けます。しかし、これらの有望な候補物質の安全性、有益な効果、有効性を正確に判断するには、動物およびヒトの臨床試験におけるさらなる生体内研究が必要です。

有望な分離株の全DNA配列は、NCBI GenBank（提出番号SUB14471673）に提出されました。生のSequencing Read Archives（SRA）は、バイオサンプルアクセッション番号（B1: SAMN41534504、B2: SAMN41534505、G1: SAMN41534506）でNCBIに寄託されました。このバイオプロジェクトの全ゲノム配列とすべてのメタデータは、NCBI GenBank（アクセッション番号PRJNA1116554）に寄託されました。

この論文の訂正が公開されました: https://doi.org/10.1038/s41598-025-97998-x

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資金提供権限はありません。

エジプト、バンハ大学理学部植物学・微生物学科

モスタファ・F・エル・ホセニー、メルバット・G・ハッサン、MO・アブデル・モネム

エジプト、カイロ、国防省、感染症および新興疾患に対するバイオディフェンスセンター

モスタファ・F・エル・ホセニー & モハメド・G・シーダウィ

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MFEは研究を実施し、データの評価と解釈を行い、原稿を作成しました。MOAは研究の計画と構成、論文の評価、プロジェクトの監督を行いました。MGSは構想、予備分析、評価、編集を行いました。MGHは分析と解釈、そして論文の評価と改訂を行いました。MGSは監督、実験の実施、データ解析と解釈、論文の改訂と評価、そしてバイオインフォマティクス解析を行いました。MOAはバイオインフォマティクスを用いてゲノムデータを評価しました。すべての著者が最終論文を査読し、出版に向けて承認しました。

連絡先は Mostafa F. El-Hosseny または Mervat G. Hassan です。

適用できない。

適用できない。

著者らは利益相反がないことを宣言します。

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本論文のオンライン版（原文ママ）は修正されました。原文ママの本論文の著者一覧に誤りがあり、第一著者のMostafa F. El-Hosseny氏がMostafa Fetoh Elhosseny氏と重複して記載され、末尾の著者として記載されていました。Mostafa F. El-Hosseny氏が第一著者であり、責任著者であるため、重複した氏名は削除されました。

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転載および許可

El-Hosseny, MF, Hassan, MG, Abdel-Monem, MO 他. エジプト産乳製品から分離した有望なLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus株の全ゲノム配列解析によるプロバイオティクス特性の解析. Sci Rep 15, 6901 (2025). https://doi.org/10.1038/s41598-025-90262-2

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受領日: 2024年9月25日

受理日: 2025年2月11日

発行日: 2025年2月26日

出典: https://doi.org/10.1038/s41598-025-90262-2

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